黄煜伦医生的科普号

CAR-T细胞可以看做是近年来方兴未艾的免疫治疗领域的代表性产品。现在的免疫治疗方法完全不同于以前的LAK细胞、CIK或DC-CIK等。近年来，嵌合抗原受体(CAR)T细胞疗法已经发生了革命性的发展。CAR是合成的T细胞受体，其将肿瘤特异性结合结构域融合至T细胞活化信号以赋予其肿瘤特异性细胞毒性。可以收集患者来源的T细胞并离体转导以表达CAR，然后返回患者以介导肿瘤根除。CAR-T细胞的肿瘤特异性很强。如果把杀伤性T细胞比作炸弹，CAR就好比炸弹上的精确制导仪。CAR-T疗法在恶性血液学肿瘤的治疗中展现出了很强的实力，包括急性淋巴细胞白血病、非霍奇金淋巴瘤，淋巴瘤等。美国FDA已经批准了4个CART细胞治疗方法；在中国复星凯特CAR-T细胞注射液申报上市获受理。CAR-T领域目前最大的挑战都是攻破实体瘤；在一项新的研究中，来自英国大奥蒙德街儿童医院和伦敦大学学院等研究机构的研究人员开发出一种旨在靶向癌性肿瘤的新型CAR-T细胞疗法，它在患有神经母细胞瘤（一种罕见的儿童癌症）的儿童身上显示出有希望的早期结果。相关研究结果发表在2020年11月25日的Science Translational Medicine期刊上，论文标题为“Antitumor activity without on-target off-tumor toxicity of GD2–chimeric antigen receptor T cells in patients with neuroblastoma”。2021年2月个案报道：上海同济十院徐清报道αPD-1-mesoCAR-T 治疗1例卵巢癌患者，治疗缩小50%，存活超过17个月。（journal of immunotherapy of Cacer, IF =10.252）2020年5月 仁济医院翟博教授和科济生物李宗海博士 CAR-GPC3 T细胞治疗肝癌。在13例患者中2例PR，中位生存时间278天，有1例患者生存时间超5年（Clinical Cancer Research IF=8.9）2017年陆军西南医院的研究：10名CEA阳性的转移性结肠癌患者，中7例患者病情稳定，2名肿瘤缩小PR，说明CAR-T细胞治疗结肠癌有效性和安全性都可观。（Mol ther,2017 25,(5): 1248-58 IF=8.99）。在国际国内复发胶质瘤患者的CAR-T治疗试验中，只有个别1-2例患者治疗有效。最近在苏州大学医学中心（苏州市独墅湖医院，苏州大学附一院附属独墅湖医院）神经外科黄煜伦主任和苏州茂行生物科技有效公司的共同努力合作下，经过两年多的工作，在最近的临床试验中，三例复发的晚期胶质母细胞瘤患者在进行手术加CAR-T细胞治疗中，展现了惊人的效果：3例患者呈现了100%的客观有效率。通过2-6个疗程CAR-T细胞治疗，核磁共振显示：1例患者呈现完全有效（CR），肿瘤消失了，两例患者呈现部分有效（PR），肿瘤缩小在30-70%之间。最长的一位患者在复发后已经存活超过21月，并且目前情况良好。（而复发胶质瘤的平均生存时间是6-7个月）。这为胶质瘤患者的治疗打开了新的一扇免疫治疗之路，曙光就在前方！本次的临床试验是目前国际上首个分泌PD-1抗体的CAR-T细胞治疗晚期复发胶质瘤患者，从仅仅用于靶向杀伤肿瘤细胞，变成了可以携带多种抗体从而改变肿瘤微环境并激活体内原有的免疫细胞联合对抗肿瘤的新的CAR-T细胞，从局部杀伤前进到“肿瘤局部杀伤+引发肿瘤局部免疫反应”，从而更好、更持久的诱导抗肿瘤作用。苏州茂行生物科技有限公司。是一家由一批在海外顶尖癌症临床治疗与研究机构生物医药专家携手创办的、以肿瘤细胞免疫治疗技术与产品研发为主要发展目标、以临床技术服务为主要业务的高科技企业本公司致力于将先进的CRISPR基因编辑技术应用于免疫细胞治疗，力求在实体瘤的治疗领域取得突破性进展。现已有专利6项，申请中专利8项，均为CAR-T细胞制备相关专利。

63岁的王老伯找到神经外科医师“人未近，味已至”在儿子的搀扶下老伯挪步而至以前的王老伯是一位风度翩翩、言谈举止相当得体的教师可是，刚从岗位上退下没多久经常忘事、记忆力明显下降走路越来越慢最近竟连小便也常常尿在身上！王老伯这是怎么了！旁人都说老伯患上了老年痴呆只有儿子不忍心看昔日为人师表的老父亲如此带着他多处问诊神经内科，骨科，泌尿外科看了个遍最终不少医师推荐他来神经外科门诊试试立即为老伯安排了头颅CT检查终于，谜底揭晓了......老年痴呆？？？非也非也是脑子”进水”了！！！！王老伯得了脑积水，属原发性正常压力脑积水，此病是发病率高、发现率低、治疗方法比较复杂的神经外科疾病之一，需要临床经验丰富的专科医生进行诊断和治疗。小编小编！我有疑问！既然是“正常压力”为何还会有脑积水？何为“正常压力脑积水”？是由于各种原因导致的脑脊液的循环或吸收障碍引起的脑室扩张、脑实质容积减少的一类疾病一般人脑脊液的压力为80—180毫米水柱，当脑脊液增多时，必然将导致压力的增高，但此类患者虽有脑积水，但压力却正常，因此得名！如何知道是否患病？以步态不稳，记忆力减退、及大小便失禁三大症状为主要特征的疾病需要提醒的是：并非所有患者均具有这三种表现。在三种症状中，最为常见的症状是行走困难。此外，这三种典型症状同样见于其它疾病，诊断时的要点仍然是脑室扩大典型症状敲黑板！谁来诊断？由于这种疾病的临床表现极易与帕金森病、阿尔茨海默病、血管性痴呆等混淆，所以其筛查、评估、诊断和治疗是一个系统工程，需要神经内科、神经外科、老年科、泌尿外科、康复科及影像诊断等多学科团队会诊治疗、多专业类型人员的参与，作好早期诊断、正确治疗才可以改善或逆转病情。但需要注意的是，“正常压力脑积水”的患者是可以通过外科干预取得较好疗效，术后患者症状能得到不同程度的改善，甚至可以逆转痴呆（也称为可逆性痴呆），回归社会和正常生活苏州大学附属第一医院神经外科团队的评估方案"三维步态分析系统及多种智力量表"如何治疗？治疗的标准方法便是脑室腹腔分流手术，此手术方式的技术较成熟，并发症发生率较低此外治疗方式还包括腰大池腹腔分流术：腰大池腹腔分流术对病因不明的常压性脑积水（iNPH）患者有明确疗效，相对安全，针对患者或家属不愿意经颅手术的情况，可作为脑室腹腔分流术的替代治疗，操作流程相对简单，且不进行颅内侵入性操作，有较低的感染风险，但其分流效果不稳定，并发症发生率较高医师提醒！如出现步态不稳、尿失禁、痴呆/认知障碍等症状，（特别是60岁以上的老年人），在神经内科，老年科，泌尿外科等科室治疗后症状仍不能好转时，需至神经外科就诊明确诊断，专家团队会针对患者自身情况，制定个体化的诊断、治疗计划。通过多学科会诊，给患者更加精准和便利的医疗服务！

1.1胶质瘤研究背景胶质瘤是指起源于神经胶质细胞的肿瘤，是最常见的原发性颅内肿瘤。近30年来，原发性恶性脑肿瘤发生率逐年递增，年增长率为1%-2%，。根据美国脑肿瘤注册中心（Central Brain Tumor Registry of the United States, CBTRUS）统计，胶质瘤约占所有中枢神经系统肿瘤的27%，约占恶性肿瘤的80%；在原发性恶性中枢神经系统肿瘤中，胶质母细胞瘤（Glioblastoma，GBM,WHOⅣ级）的发病率最高，占了46.1%，约为3.20/10万，且男性多于女性；其次是弥漫性星型细胞瘤，发病率为0.53/10万。GBM的发病率随着年龄的增长而增加，最高发的年龄为75~84岁，新诊断的中位年龄是64岁[2]。胶质瘤临床表现主要包括颅内压增高及神经功能缺失，诊断主要依靠CT及MRI检查等影像学诊断。胶质瘤治疗以手术切除肿瘤为主，结合放疗、化疗等综合治疗方法。手术可以缓解临床症状，延长生存期，并获取足够标本用以明确病理学诊断和进行分子生物学研究。放疗可杀灭或抑制残余肿瘤细胞，延长患者生存期，分割外放射治疗已经成为高级别胶质瘤的标准疗法。胶质瘤具有原位复发特点，且90%发生在距原发灶2cm的范围之内，故优化局部放疗方案是治疗的焦点。胶质瘤的化疗一直是采用单药和多种药物联合应用的方案。欧洲癌症研究治疗组织（EORTC）和加拿大国立癌症研究院（NCIC）的大规模Ⅲ期临床试验证实，莫替唑胺（TMZ）联合同步放疗，继以6周期TMZ辅助化疗可延长患者生存期，2年生存率由10.4%提高至26.5%。手术后，TMZ同步放疗联合辅助化疗已经成为新诊断GBM的标准治疗方案。但是，目前胶质瘤的治疗效果总体欠佳，成人高级别胶质瘤的1年及5年生存率分别为30%和13%，间变形胶质瘤及GBM的中位生存时间分别为2~3年和1年[3]。因此，胶质瘤治疗新方法建立是临床所需。1.2嵌合抗原受体T细胞（CAR-T细胞）1985年，Rosenberg SA首次向外界公布了LAK联合IL-2治疗恶性黑色素瘤的临床研究结果。之后，在此基础上相继演化了多种方案，如第一代的淋巴因子激活的杀伤细胞疗法（Lymphokine Activated Killer，LAK），第二代的细胞因子诱导的杀伤细胞疗法（Cytokine Induced Killer cell，CIK），第三代的肿瘤浸润性淋巴细胞疗法（Tumor Infiltrating Lymphocytes，TIL），第四代的细胞毒性T细胞疗法（Cytotoxic T Lymphocytes，CTL），以及第五代的嵌合抗原受体T细胞疗法（Chimeric Antigen Receptor-modified T cells，CAR-T）。嵌合抗原受体T细胞（CAR-T细胞）：CAR-T细胞治疗是利用基因工程技术将受试者T淋巴细胞体外转染嵌合受体CAR，形成对特定抗原有特异性识别能力的效应T细胞，经过体外扩增后回输到受试者体内，回输的CAR-T细胞通过高效特异的非MHC限制性方式识别特定的肿瘤细胞表面抗原，并对肿瘤细胞完成杀伤[4,5]。CAR受体通常编码一个包含单链抗体scFv，以结合肿瘤细胞表面特异性抗原；同时连接有细胞内信号转导结构域，通常为CD28或/和4-1BB共刺激分子及CD3ζ胞内信号域，介导T细胞的活化[6,7]。2017年，FDA批准了靶向CD19的基于4-1BB的二代CAR-T产品上市。1.3 EGFRVⅢ抗原简介EGFR（表皮生长因子受体，ErbB-1）是在细胞表面表达的ErbB家族的受体酪氨酸激酶（RKT），该受体的过度表达或过度活性突变为癌变[8]。EGFR过度表达及突变以多种不同形式出现于肺癌、肛门癌及多形性成胶质细胞瘤(GBM)中，EGFR的Ⅲ型突变体（EGFRvⅢ）是在胶质母细胞瘤中最常见的EGFR变体[9-12]。EGFRvⅢ的特征为EGFR基因的外显子2-7缺失，结果导致编码区801个碱基对的框架内缺失，即缺失6-273个氨基酸残基（根据成熟EGFR的残基数），以及在融合连接处产生新的甘氨酸[13]。已证实EGFRvⅢ具有不依赖于配体、较弱但组成型地活化激酶的活性以及具有增强的致瘤性[14,15]。在脑肿瘤中，细胞信号主要通过EGFRvⅢ的PI3K和AKT为主要信号传导途径，通过次要途径的Stat-3、AP-1或MAPK激活，其促进癌细胞增殖，抵抗程序性细胞死亡、血管发生、增加癌细胞穿透、形成癌干细胞等[16]。最近的研究报道EGFRvⅢ在致癌作用中通过mTORC2激活NF-κB而起到重要作用[17]。除了在胶质瘤以外，已在导管和导管内乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌以及头颈部鳞状癌中检测到了EGFRvⅢ[18-22]。与之相反的是，在其他研究报道中发现正常组织中不表达EGFRvⅢ[18,19,23]。EGFRvⅢ高度肿瘤特异性的性质使其成为用于治疗表达这种分子的癌症和肿瘤的特别有用的靶点。1.4 EGFRvⅢ抗原相关临床前及临床研究资料综述发表在2015年Sci Transl Med上的一篇文章中，Laura A.Johnson[24]等构建了三种人胶质瘤小鼠模型，其中2种人胶质瘤原位移植小鼠模型并联合/不联合化药莫替唑胺治疗，1种皮下接种人胶质瘤小鼠模型，3组小鼠模型给予静脉单次回输CART-EGFRvⅢ细胞后。作者通过活体成像、皮下肿瘤大小测量、脑部肿瘤MRI检测发现：MRI检测发现脑部的肿瘤可以被CART-EGFRvⅢ清除，但是用了替莫唑胺后肿瘤复发。可以确认的是CART-EGFRvⅢ细胞可以穿过血脑屏障到达脑部胶质瘤部位，这提示通过静脉回输CART-EGFRvⅢ细胞治疗胶质瘤是一种可行的技术方案。Hongsheng Miao[25]等也发现在用人胶质瘤组织分离的D-270MG构建的小鼠模型中，EGFRvIII+ CAR-T细胞能够到达肿瘤部位并识别肿瘤细胞，同时可以抑制肿瘤的生长并延长小鼠的生存期。在一项单剂量静脉回输CART- EGFRvⅢ细胞治疗GBM患者的Ⅰ期临床试验中[26]，10例复发/难治性GBM患者接受了CAR-T细胞治疗，其中3例患者在输注CAR-T后未接受手术治疗，3例患者在输注后的34、55、105天接受了手术，4例早期接受手术治疗并表现出明确症状恶化的患者，接受了CAR-T并联合进行了临床适应的手术。该临床试验的主要终点是安全性评估，论文的一作Donald M. O’Rourke强调，1）没有发现EGFR的脱靶毒性症状，如皮疹、腹泻及肺部症状；2）没有发现系统性的细胞因子释放综合征；3）3例患者经历了神经毒性症状，其中1例患者在第9天出现癫痫，在给予类固醇和抗癫痫药治疗后，患者精神状态回归基线水平；1例患者在第15天时经历神经衰退，给予高剂量的类固醇治疗后于第29天给予IL6抗体治疗，临床评价该例患者所出现症状与疾病进展一致；1例患者出现神经衰退，但该例患者是术后延迟出血患者。神经毒性症状有可能是由于CART-EGFRvⅢ细胞回输导致，但是胶质瘤患者群体本身也易出现这种症状。尽管该临床试验的主要终点不是疗效评估，但是有1例患者在随访18个月时病情仍然稳定，并在公布数据时仍然健在；另有2例患者也健在，但表现出病情进展；其余7例患者的生存时间比根据其治疗史和多灶性肿瘤复发所预测的生存时间均表现出稳步延长。本试验方案药物MT014为靶向EGFRVIII的CAR-T细胞注射液，其结构包含靶向EGFRVIII的单链抗体scFv、CD8跨膜区、CD28/4-1BB的共刺激信号及CD3ζ胞内信号结构域。本临床试验药物MT014已完成一系列体外试验以评估MT014药物的杀伤特异性和效力。为确定MT014是否可介导EGFRVIII阳性肿瘤细胞的特异性杀伤，将构建的CART-EGFRVIII细胞与胶质母细胞瘤细胞系U251 WT/EGFRvIII、U87WT/EGFRvIII共培养。结果显示CART-EGFRVIII细胞能够特异性的杀伤EGFRVIII阳性的肿瘤细胞，对EGFRVIII阴性表达的胶质瘤细胞没有杀伤效果；细胞因子检测发现CART-EGFRVIII与EGFRvIII阳性的肿瘤细胞共培养时能够分泌较高浓度的细胞因子，而CART-EGFRVIII与EGFRvIII阴性的肿瘤细胞共培养时能够分泌的细胞因子水平极低，说明CART-EGFRVIII对EGFRvIII阳性的肿瘤细胞具有高特异性的杀伤效果。受试者选择标准1）年龄18～65周岁，男女均可，预生存期大于3个月；2）既往活检或病理组织学证实高级别胶质瘤（WHO 3或者4级），经综合治疗后，影像检查提示继续进展或复发；3）手术切除的病理组织能够用于EGFRvIII的免疫组化检测，且符合病理学诊断的EGFR VIII阳性表达（免疫组织化学染色++或+++）；4）对于正在服用地塞米松的患者，在采血前5天其服用剂量必须不高于4mg/天；5）足够的静脉通路用于抽血和静脉血采样，无淋巴细胞采集禁忌症；6）常规血液检查：白细胞计数（WBC）≥3×109/L，淋巴细胞百分比（LY%）≥15％，血红蛋白Hbo（Hb）≥90g/ L，血小板（PLT）≥60×109/L；7）肝，肾功能：丙氨酸转氨酶、天冬氨酸转氨酶（ALT、AST）<正常值的3倍，总胆红素（TBiL）<正常值的1.5倍，血清肌酐（SCr）<正常值的1.5倍；8）受试者自愿加入本研究，签署知情同意书，依从性好，配合随访。具体情况可以来苏州大学附属第一医院神经外科胶质瘤门诊进行咨询（周三下午，十梓街院区）黄煜伦主任。

脑脊液鼻漏是脑脊液通过颅底（颅前、中或后窝）或其他部位骨质缺损、破裂处流出，经过鼻腔，最终流出体外。主要表现为鼻腔间断或持续流出清亮、水样液体。病因这类脑脊液鼻漏发病原因可分为自发性、肿瘤性和先天性。分类脑脊液鼻漏有多种分类方法，依据解剖部位，病因，颅内压等。由于病因学影响到脑脊液鼻漏的治疗和预后，根据病因分类在临床上最有价值。（1）肿瘤源性脑脊液鼻漏鼻窦、颅底肿瘤可直接或间接导致脑脊液鼻漏。这些肿瘤可能是原发性中枢神经系统肿瘤扩展到鼻腔，也可能是鼻腔、鼻窦肿瘤迁延至颅内。针对肿瘤的治疗，如手术、放疗或化疗，可导致漏口周围缺血及颅底被侵袭而难以修补。肿瘤也可阻塞脑脊液循环引起颅内压升高而间接导致脑脊液鼻漏。（2）先天性脑脊液鼻漏先天性脑脊液鼻漏多发生在筛板、筛窦顶附近。常见的原因是颅底发育畸形，颅底骨质缺损。先天性脑脊液鼻漏患者颅内压常在正常范围，也可伴发颅内压力升高。（3）自发性脑脊液鼻漏自发性脑脊液鼻漏病因不明，故又名原发性或特发性脑脊液鼻漏。最常见漏口部位为筛板，其次为蝶骨侧凹，可能因筛板或鞍底缺血萎缩，后被充满脑脊液的蛛网膜囊填充，脑脊液搏动性冲击颅底，进而侵袭局部骨质形成缺损，最终导致脑脊液鼻漏。临床表现主要表现为鼻腔间断或持续流出清亮、水样液体。单侧多见。在低头用力、压迫颈静脉等情况下有流量增加的特点者，提示脑脊液鼻漏可能。检查1.鼻内镜检查可常规使用，定位漏口准确。脑脊液持续外流时，内镜可能直接发现脑脊液鼻漏的部位，脑脊液漏液量少或间断流出时，可以配合使用鞘内注射荧光素，以便发现漏口。检查时压迫双侧颈内静脉致颅压升高，有利于观察到漏口。2.葡萄糖氧化酶检测该技术是一种传统的诊断方法，由于泪液和鼻黏液含糖，故糖定性不可靠，可行糖定量检测。检测鼻腔漏出液中葡萄糖的浓度，并与血清中葡萄糖的浓度进行比较，若比值为0.50～0.67，在排除其他可引起脑脊液和血清中葡萄糖浓度变化的因素下，该漏出液很可能是脑脊液。如漏出液中葡萄糖浓度大于1.7mmol，亦可明确诊断。3.CT及CT脑池造影高分辨率CT，层厚可薄至1mm，微小病变检出率明显提高。三维CT成像技术行颅底重建，更加直观地显示骨折情况，以明确漏口部位。CT脑池造影特异性高，能直接显示脑脊液鼻漏的漏道形态、大小、位置及数量。但不能全面了解漏口情况，对骨质结构显示不清，与CT相结合，则更加完善。4.MRI及MRI水成像常采用脑脊液最易漏出的体位，即俯卧位，选择轴位、矢状位或冠状位的T1加权像T2加权像平扫及脂肪抑制的快速自旋回波T2加权像，或者3DSPACE相可确定病因及漏口部位。现广泛使用的MRI水成像技术，定位漏口准确。诊断脑脊液鼻漏的诊断主要依靠症状、体征和辅助检查。症状：一侧或双侧鼻孔持续或间歇性流出清亮液体，向一侧倾斜、低头或压迫颈静脉时症状加重；或漏水较少，但晨起时发现枕边潮湿。也有仅表现为反复颅内细菌性感染，鼻漏并不明显。患者多在神经内科按照脑炎反复治疗。鉴别诊断1.变应性鼻炎2.鼻窦黏膜下囊肿并发症颅内感染和低颅压。也有患者持续高颅压，即使有鼻漏的情况，还呈现一种良性颅内压增高，可能需要脑室腹腔分流手术，降低颅内压。治疗1.非手术治疗一般情况下脑脊液鼻漏的患者先保守治疗，疗程可根据病情而定，一般为2～4周左右，期间应密切观察。非外伤性鼻漏保守治疗效果不佳。腰大池置管引流对于外伤性脑脊液鼻漏，则可行腰大池引流5～7天。患者平躺，侧卧位选择L3～4或L4～5间隙穿刺，置管入蛛网膜下腔，末端接无菌引流袋，调节引流袋的高度来控制引流量。腰大池置管能降低颅内压，减少脑脊液流出量，有利于脑脊液鼻漏的自行愈合。2.内镜手术治疗具有微创，效果好等优点，目前可由神经外科联合五官科医师共同联合手术内镜下鼻内入路脑脊液鼻漏修补术1981年Wigand首次成功用纤维蛋白胶经鼻内镜下修复脑脊液鼻漏，现在该项技术广泛开展，显示出其极大的优势，报道有超过90%的成功率，为耳鼻咽喉科医生常用。鼻内镜修补术是治疗筛顶窦和蝶窦脑脊液鼻漏的首选术式，手术难点是术中漏口位置的确定，借助鼻内镜仔细寻找脑脊液鼻漏的来源，然后清除漏口周围的肉芽组织及坏死组织，充分冲洗术区，使用肌肉筋膜等修复材料，充分铺盖漏口，压迫。但是当颅底骨质缺损或漏口较大时可首选经颅脑脊液漏修补术，根据术中情况，又可采用硬膜外入路硬膜内入路及二者联合入路。优点是直视下修补漏口，可同时处理其他颅内病变；缺点是术中不易找到漏口，创伤较大，手术及住院时间较长，嗅觉多受影响。3.术后治疗（1）卧床休息：一般采用头高20～30°半坐位，卧向患侧，脑组织可沉落于漏口，促使愈合。（2）保证鼻腔洁净：避免局部细菌生长。（3）预防颅内压增高：可酌情使用甘露醇、速尿等降低颅内压，防止感冒，保持大便通畅，给予通便药物以避免便秘，不宜行屏气、擤鼻及咳嗽等增加颅内压动作。（4）术后应用抗生素。术后鼻腔填塞物一般要12-14天拔除

【招募患者】伴有EGFR扩增胶质母细胞瘤在同步放化疗及TMZ化疗中联合使用ABT-414进行的随机安慰剂对照2b/3期临床研究1.试验药物简介ABT-414是抗表皮生长因子受体（EGFR）单克隆抗体-药物偶联物（anti-EGFR ADC）。本试验适应症是初诊为伴有表皮生长因子受体扩增的胶质母细胞瘤。2.试验目的测定在放疗与TMZ化疗联合+辅助TMZ化疗的治疗方案中加入ABT-414是否可延长初诊的伴EGFR扩增GBM受试者的无进展生存期（PFS）和总生存期（OS）。3.试验设计试验分类：安全性和有效性试验分期：其它设计类型：平行分组随机化：随机化盲法：开放试验范围：国际多中心入组人数：总体720人，中国60人4.入选标准1组织学证实的原发Ⅳ级胶质瘤（GBM、胶质肉瘤或其他亚变异），由中心病理组织筛选确认。2中心实验室评价已确认肿瘤组织的EGFR扩增。3修正案5中删除了该项入选标准。4在入选临床试验前，受试者必须已经从外科手术的影响中、术后感染以及其他并发症中恢复，包括脑外科手术后的缝线应已拆除，在开始随机分组之前伤口已较好地恢复或愈合。5年龄≥18岁。6在随机分组开始前的14天之内进行Karnofsky体能状态评分，分数≥70。7应在随机分组开始前准备好分层因素（EGFRvIII状态、MGMT甲基化状态、递归分割分析（RPA）等级以及患者所在国家或地区）需要的结果。8在开始随机分组至少21天前，受试者的骨髓及肝肾功能需达到以下标准：a)中性粒细胞绝对计数(ANC)≥1,500/mm3；b)血小板≥100,000/mm3；c)血红蛋白(Hgb)≥9.0 g/dL（注意：通过输血或其他干预达到Hgb≥9.0 g/dL的水平也是可以接受的）；d)肾功能：使用克罗夫特-高尔特公式计算所得的肌酐清除率≥30ml/min；e)肝功能：总胆红素≤标准上限（ULN）的1.5倍，谷草转氨酶（AST）和谷丙转氨酶（ALT）≤标准上限(ULN)的3倍。病史中记载Gilbert综合征的受试者，如果总胆红素<3倍标准上限，则也可考虑入选。9在随机分组开始前的21天内，心电图（ECG）未提示急性心肌缺血。10育龄女性受试者（比如，那些绝经不满一年或者未进行过双侧输卵管切除术、双侧卵巢切除或子宫切除术的女性）应该在研究入选期间，以及整项研究进行期间和使用ABT-414和TMZ治疗结束后6个月内，至少使用以下所列任意一种可接受的避孕措施。研究期间以及ABT-414和TMZ治疗后至少6个月内，男性受试者应采取至少一种可接受的避孕措施。如果使用安全套，则在研究期间以及ABT-414和TMZ治疗后至少6个月内，应采取下述至少另一种避孕措施：1）研究第1天前至少1个月内开始使用可以抑制排卵的复方（含雌激素和孕激素）激素避孕药（口服、阴道内、透皮给药）；2）研究第1天前至少1个月内开始使用可以抑制排卵的仅含孕激素的激素避孕药（口服、注射、植入式）；3)双侧输卵管封堵/结扎；4)完全禁止性交：避免异性性交，如果这符合受试者的首选和日常生活方式【不允许定期禁欲（例如日历法、排卵法、症状体温法、排卵后法）和体外排精法】；5)男性受试者或女性受试者的男性伴侣需进行过输精管结扎术；6)使用宫内节育器(IUD)（女性）；7)宫内激素释放系统(IUS)（女性）；8)双屏障法（避孕套、避孕海绵、隔膜或含有杀精凝胶剂或乳膏的阴道环），除非不被当地法规视为可接受的高效避孕措施。11在开始随机分组7天之内，育龄女性受试者妊娠试验结果必须为阴性（尿检或血清）。12开始任何筛选或研究流程前，受试者应自愿签署同意参加研究和肿瘤组织生物标志物测试的知情同意书并注明日期，该知情同意书需经独立伦理委员会（IEC）/独立机构审查委员会（IRB）批准。5.排除标准1受试者患有多灶性GBM，定义为离散性病灶，不存在需要不同放疗入口的相邻T2/FLAIR异常。允许以下卫星病灶：伴有与主要病灶相同的连续T2/FLAIR异常部位，且与主要病灶在同一个放疗入口。2修正案5删除了此项排除标准。3受试者存在GBM复发。4修正案5删除了此项排除标准。5受试者患有转移性GBM。6受试者曾对头颈部区域肿瘤进行过化疗或给予放射增敏剂治疗；请注意除替莫唑胺外，曾因其他类型肿瘤进行化疗是可以接受的。7曾对头部或颈部进行过放疗（除外T1声门癌），导致放射区域重叠。8曾就胶质母细胞瘤进行过其他治疗，除外手术（利用术中技术引导切除以及实验影像检查是允许的）。9曾罹患侵袭性恶性肿瘤（除外非黑色素瘤皮肤癌；乳腺、口腔或宫颈原位癌），除非已经痊愈至少2年以上。10曾、正在或与抗肿瘤目的的治疗〔包括但不限于Novo TumorTreatment Fields（Novo TTF）、EGFR靶向治疗（包含直接针对EGFRvIII的治疗）、贝伐单抗、格立得（卡莫司汀晶片植入剂）〕联用或者其他瘤内或腔内抗肿瘤疗法、或其他旨在治疗肿瘤的实验疗法联用；诊断性或影像研究、生活质量、生物标志物或者流行病学研究，以及改善切除范围的手术指南除外。11对含有IgG药物存在主要免疫反应的受试者。12在过去一年中进行过LASIK（准分子激光原位角膜磨镶术）手术或在最近3月内进行过白内障手术的受试者。13对TMZ或赋形剂、ABT-414成分或其赋形剂和达卡巴嗪（禁用TMZ）有过敏病史的受试者（TMZ禁忌症）。14不适合接受眼用类固醇的受试者：1）受试者患有活动性角膜或结膜病毒疾病，包括上皮单纯疱疹病毒性角膜炎（树枝状角膜炎）、牛痘、水痘；眼分枝杆菌感染；眼组织真菌性疾病或任何其他眼部使用类固醇禁忌症。2）已知或怀疑受试者对眼类固醇具超敏反应。3）受试者患有原发开角型青光眼或者曾经发生过类固醇诱发的眼压升高。15受试者为哺乳期或妊娠女性。16如下定义的严重、活动性并发症：1）重度肝功能损害（Child-Pugh C级或更高[即评分≥10分]（见附录VII））；但对于轻度或中度肝功能损害（Child-Pugh评分5-9分），如附录IV所述，此类受试者可以接受治疗。2）在过去6个月内发生的不稳定型心绞痛和/或充血性心力衰竭；3）在过去6个月内发生过透壁性心肌梗死；4）在入组21天前使用心电图分析得出的结论S-T段抬高≥2 mm，证实近期心肌梗死或缺血；5）纽约心脏病协会II级或以上充血性心力衰竭，在登记前12月内需要入院治疗的（附录IV）；6）六个月内有过中风、脑血管意外（CVA）或短暂性缺血发作病史；7）严重的、控制不佳的心律失常；8）在入组时因急性细菌或真菌感染，需要静脉输注抗生素的；9）需要在入组时间入院进行预防性研究治疗的慢性阻塞性肺疾病加重期或其他呼吸系统疾病；10）临床诊断为获得性免疫缺陷综合症（AIDS）的受试者，保证其有可能接受完整的TMZ方案治疗是很有必要的；11）活动性结缔组织疾病，如狼疮或硬皮病，根据研究者判断，本研究中可能将受试者置于放射毒性高风险中；12）研究者认为不应接受或完成治疗方案的其他主要内科疾病或精神障碍；17在研究开始前30天内或者在参与过程中接受过其他治疗临床方案的受试者，除了术中治疗引导切除或无治疗目的的实验性影像检查。18无法进行MRI增强扫描。6.主要研究者信息序号机构名称主要研究者国家省（州）城市1复旦大学附属华山医院毛颖中国上海上海2北京协和医院马文斌中国北京北京3中国人民解放军第四军医大学唐都医院王樑中国陕西西安4福建医科大学附属第一医院康德智中国福建福州5华中科技大学同济医学院附属同济医院雷霆中国湖北武汉6苏州大学附属第一医院王中中国苏州苏州受试者收益：除常规医学治疗支付的费用，受试者无需支付该研究所要求以下项目替莫唑胺（TMZ）；ABT-414；预防性滴眼液；研究过程中的检查项目：MRI，眼科检查，心电图检等；其他临床实验室检查：血液学检查，临床生化检查，尿液分析。交通补助：按照实际发生的差旅费用，每次访视最高300元。费用将在研究结束或定期向受试者支付。苏州大学附属第一医院：王中主任：门诊时间：周三上午（老院），黄煜伦主任：门诊时间：周一全天，周三下午神经外科胶质瘤门诊（老院）。

张学文 综述 黄煜伦 审校苏州大学附属第一医院神经外科，江苏苏州215000摘要：液体活检是指一种通过非侵入性检测的方法来检测患者的血液、脑脊液或尿液等中的某些生物活性分子。通过对检测结果分析进而对癌症等疾病做出早期诊断。近年来研究显示外泌体、ctＤＮＡ、ＣＴＣ及自身抗体的检测在胶质瘤患者的早期诊断中发挥着潜在的优势，并且这些指标对预后以及复发监测有一定的意义。深入研究这些液体活检的方法，将会为我们提供新的胶质瘤的早期诊断方法和并有助于提高临床治疗的效果，延长生存时间。关键词：液体活检；胶质瘤；诊断肿瘤的确诊现如今仍是以肿瘤组织的病理结果作为诊断的金标准，随着科学技术的进步和对肿瘤的进一步深入研究，我们发现通过病理学诊断肿瘤具有一定的局限性：1.肿瘤具有异质性，2.由于患者自身的条件或受到当前医学技术条件的限制导致不能得到活检所需要的肿瘤组织，3.在肿瘤组织活检得出结果之前，只能给予患者经验性的治疗方案。鉴于以上的局限性，就需要一个能对癌症进行早期诊断并且能使患者得到早期治疗的检测技术。1.目前提出的非侵入性液体活检的方法可以解决以上病理活检的局限问题，也能减少对肿瘤早期诊断所需要的时间。液体活检最大的优势就是它具有非侵入性，这样就能降低活检的潜在危害性，敏感性高和速度快等也是液体活检所具有的优点，而这些优点能使临床医生提早发现肿瘤。由于液体活检具有非介入性和提取肿瘤样本可重复性的特点，所以我们可以通过分析患者的定期检查结果进而调整临床上的治疗方案。目前液体活检方法主要进行包括细胞外泌体的检测、ctDNA检测、CTC检测、抗原检测及自身抗体检测等[1]。现将胶质瘤的液体活检的方法和最新进展进行总结如下：1.1外泌体检测外泌体是起源于活细胞内吞途径的多泡体，它通过与质膜相融合，最后被释放到细胞外微环境中，由于外泌体的直径约30-100nm，所以其通透能力较强，易达到体液中去，这样就为进行外泌体的检测提供了可能[2]。最近的研究表明外泌体可介导细胞间的信息传递，而旁分泌可能就是外泌体介导细胞间信息传递的方式[3]。不同的外分泌体所携带的分子不同，各外泌体也就具有了不同的生物学功能，我们就可以利用这个特点进而对不同的肿瘤疾病进行早期诊断，而且也可以对肿瘤患者的预后进行判断和对肿瘤患者诊疗的效果进行评估。例如在进行外泌体的检测分析中，由于肿瘤细胞分泌的外分泌体中含有DNA、mRNA或者microRNA，而通过对这些携带物的分析，又可以得出原发肿瘤的性质，进而形成了对肿瘤的诊断[4]。破坏了的血脑屏障有利于胶质瘤细胞分泌的外泌体进入血液，然而即使在一些血脑屏障保持完好情况下的胶质瘤患者中，其血液里也能检测出胶质瘤细胞分泌的外泌体，相关研究已经分别从这两种胶质瘤患者的外泌体中检测到胶质瘤细胞的一个重要生物标志：IDH1G395A[5]。外泌体中的DNA既有单链的也有双链的，在利用全基因组测序法检测外泌体中的DNA时发现：外泌体中DNA的全基因组与肿瘤细胞的全基因组具有高度的一致性[6]。大部分外泌体中的mRNA具有稳定性差和容易降解的特征，而外泌体中的microRNA却显示出含量高和具有较稳定性的特征，因此，外泌体中的microRNA更具有诊断价值，并且这一诊断价值在胶质瘤、乳腺癌等多种肿瘤的诊断中发挥着明显的优势[7]，这也表明外分泌体对胶质瘤具有诊断的价值。鉴于外泌体的种类较多，这就需要我们要建立一个可靠的方法来分离出所需的外泌体，再者由于目前我们还不清楚外泌体保留遗传信息的具体过程以及仍不能精确地知道胶质瘤细胞分泌哪种外泌体可对其诊断具有较高的价值，因此仍需要我们继续的深入研究。1.2循环肿瘤细胞检测（CTC）所谓的循环肿瘤细胞就是指这样的一类细胞，它是从实体瘤的原发灶或转移灶脱落而进入循环系统的肿瘤细胞。近年研究发现胶质瘤细胞微环境中不同细胞之间的交流是胶质瘤侵袭的开始，而CTC则是侵袭的基础，其扮演着诱导胶质瘤复发形成的角色，并保留着原发肿瘤的特性，这就为临床医生尽早发现胶质瘤发生侵袭并对患者的预后评判提供了可能，因此备受关注[8]。Engell在1955年就证实了循环血液中有CTC的存在[9]，现研究表明脱落了的CTC由于外部环境的改变导致其在外周血中的生存期大大缩短，而在循环血液中的CTC却有着生存能力强和侵袭力高的特点，他们往往通过聚集而对微环境产生侵袭的作用，因此通过分析循环血液中CTC的检测结果可对肿瘤进行早期的诊断以及治疗效果进行评估[10]，这种应用已经在胶质瘤患者中得以实现，并且通过检测结果进行分析也能动态了解肿瘤患者的病情进展和对患者预后进行评估。当前这项技术仍有它的不足之处，由于人体的循环体液量较多且处于不断更新的状态中，从而导致了循环的体液中含有CTC的量很少，有研究表明要检测105-107个单核细胞才能检测到1个CTC[11]，而另一不足之处是现如今对CTC的研究只是局限于小样本的研究，要使其具有更高的临床应用价值，就需要我们进行大规模、多样本的深入研究。1.3 ctDNA检测所谓的循环肿瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）就是指肿瘤细胞释放到周围微环境甚至体液中的一种遗传物质。研究发现血液循环中也存在着另外一种DNA，它处于无细胞结构和游离状态，我们称之为血浆游离DNA(cell-free DNA，cfDNA),由于ctDNA是cfDNA中的一种，所以提取ctDNA目前多从血浆中进行。在胶质瘤生长的早期，5×107个胶质瘤细胞在血液中所产生的ctDNA数量就能达到对胶质瘤进行早期诊断的检测要求，但这个数量级的胶质瘤细胞团却在影像学上不能显示[12]，从而使通过检测血液中的ctDNA数量就能对胶质瘤进行早期诊断。时间和空间上的异质性是胶质瘤的一个特征，由于这个特征我们必须定期检测ctDNA并对其结果进行分析，再对患者实施有效的靶向治疗，从而避免延误实施更改治疗方案的时机。ctDNA也能帮助外科医生鉴别出脑部胶质瘤的复发与脑部的放射性坏死疾病，根据ctDNA的定性、定量分析可以发现耐药基因，这样就更加有助于胶质瘤患者后续的治疗[13]。但将ctDNA检测应用于临床仍有它的现实局限性，由于ctDNA在循环血液中数量少，且易被cfDNA遮盖，因此需要提高灵敏性，再者不能通过ctDNA的结果分析实现肿瘤的定位，也不能通过结果分析在细胞功能方面对其进行研究，ctDNA的检测结果还没有一个统一的标准来指导其在临床上的应用也是它的一个亟待解决的问题。1.4自身抗体检测所谓自身抗体是指由自身的免疫系统所产生的一类抗体，这类抗体是由针对自身的蛋白、细胞、组织、甚至器官所产生的，如系统性红斑狼疮病及类风湿性关节炎病患者体内所产生的自身抗体。研究发现，体内抗原就如同某种模板在体内产生聚合酶链反应那样使免疫应答产生了生物信号放大的作用，从而诱导产生针对肿瘤的自身抗体，这样就能使抗肿瘤血清抗体在肿瘤抗原还没有被发现之前就被检测出来[14]。由于相关肿瘤抗体在肿瘤被影像学发现之前就已经在体内产生，且在不同的癌症患者血清中也已经找到了具有诊断价值的相应抗体，从而表明了这些自身抗体可作为肿瘤检测的早期标志物。现在已有多种具有肿瘤抗原相关的自身抗体被发现，例如抗p53抗体在30%-40%的肿瘤患者体内被检测到[15]；AnnexinI和II的自身抗体在60%肺腺癌及33%肺鳞癌患者中被检测到[16]；抗Mucin1（MUC1）、Rad51的自身抗体在胰腺癌患者体内被检测到[17]；上皮细胞粘附分子（EpCAM）的自身抗体在卵巢癌患者体内被检测到。由于恶性肿瘤的生长具有复杂性和异质性的特征，仅仅通过检测体内一个相关抗体对肿瘤进行早期诊断往往会出现诊断的灵敏度和特异性都不高的现象，鉴于这种不利的事实，当前我们往往通过组合多种自身抗体的方式对这些疾病进行早期诊断。这在前列腺癌的早期诊断中已得到了应用，Bouwman等[18]利用蛋白芯片技术，检测出并组合了关于前列腺癌的自身抗体组，从而使前列腺癌的诊断敏感性提高到81.6%，特异性提高到88.2%。在中枢神经系统中脑胶质瘤是脑部最常见的恶性肿瘤，由于恶性程度高从而严重影响了患者的治疗和预后。现行的检测手段多为影像学诊断，但价格昂贵，因此，开发出针对脑胶质瘤的简便血清学早期诊断方法就显得十分必要了，因为对于早期胶质瘤患者，通过提高手术全切率可以改善患者的预后，为了提高脑胶质瘤的血清学诊断灵敏度就需要在患者的血清中找到具有特异性和敏感性均较高的自身抗体。肿瘤的自身抗体在多种癌症患者的血清中已被检测出，例如肺癌、乳腺癌、前列腺癌、结肠癌等，但在脑胶质瘤患者的血清中并不多见，这可能是由于血脑屏障的作用，阻止了胶质瘤细胞与免疫细胞的接触而引起的。p53基因具有野生型和突变型两种类型，通常认为p53的过表达与肿瘤的转移、复发及不良预后具有着相关性。p53基因突变后失去正常功能，并能抑制野生型p53的活性或使之失活，呈现隐性癌基因作用。野生型p53基因所产生蛋白的稳定性极差，不易被检测出，而突变型p53基因所产生蛋白的稳定性比野生型p53基因所产生蛋白的稳定性要有所增加，半衰期也相应的延长，从而可通过免疫组化方法将突变型p53检测出来。且机体能产生抗p53蛋白的自身抗体，这在多种癌症中已被检测出，在脑胶质瘤的发生中p53突变也起着重要作用[19]。在检测抗胶质瘤的自身抗体实验中，Pallasch等[20]首先确定了三个抗原自身抗体，包括GLEA1、GLEA2和PHF3，在62例胶质瘤病人中：有约占24.2%的患者对GLEA1血清抗原起反应，有约占48.4%对GLEA2血清抗原起反应，有约占56.5%对PHF3血清抗原起反应。通过对患者生存期随访他们发现：未检测到GLEA2血清抗体和PHF3血清抗体的患者，其中位生存期为7.2个月，血清中检测到GLEA2血清抗体的患者，其中位生存期增加到17.4个月，检测到PHF3血清抗体的患者，其中位生存期增加到14.7个月，而研究发现含有GLEA1血清抗体与患者的中位生存期却无相关性。Survivin属于凋亡抑制蛋白（IAP）中的一种，常在癌组织中表达。Soling等[21]通过Elisa和免疫印迹法对脑膜瘤及高级别胶质瘤患者进行Survivin自身抗体分析显示：在42例脑膜瘤患者体内有5例产生Survivin自身抗体，35例高级别胶质瘤患者体内有3例产生Survivin自身抗体；通过分析还发现Survivin自身抗体至少可在脑肿瘤患者的血清中产生，且脑肿瘤病人当中至少有20%的血清中含有Survivin自身抗体，这一数据恰恰与肿瘤细胞的免疫组化结果是一致的，从而说明了利用Survivin自身抗体作为脑胶质瘤病的一种新的诊断方法和随访工具是具有可行性的。FLNC（细丝蛋白）是存在于平滑肌等组织中且含有肌动蛋白结合结构域的一种蛋白质，它往往被限制在肌肉组织当中，近期研究发现在神经胶质瘤患者血清中也存在抗FLNC的自身抗体，并证实了低级别的神经胶质瘤患者血清中的抗FLNC自身抗体的量明显高于高级别的神经胶质瘤患者血清中抗FLNC自身抗体的量，从而利用这一特点可以鉴别早期低级别与高级别胶质瘤[22]。GFAP是一种具有细胞骨架成分的酸性蛋白，相对分子量约为50000-52000，它在细胞延伸的过程中起到稳定细胞结构的作用，并且还具有支持和保护胶质细胞的作用，从而控制着胶质细胞的形状、运动及功能；它也是星形胶质瘤细胞的标志性蛋白，从而可以确定颅内胶质瘤的起源。研究发现GFAP可作为脑胶质母细胞瘤的血清检测指标[23]，并且表明脑胶质瘤患者血清内含有的GFAP水平与其肿瘤大小在高级别脑胶质瘤中存在着正相关性[24]；通过检测非脑胶质瘤的脑瘤患者血清或者非脑瘤的志愿者血清中的GFAP自身抗体的量显示以上患者血清中含GFAP自身抗体的量比脑胶质瘤患者血清中GFAP自身抗体的量明显低的多，从而也说明GFAP自身抗体水平的升高对神经胶质瘤患者的诊断是具有一定的特定性的[25]，这也说明通过检测脑胶质瘤患者血清中的GFAP自身抗体含量对脑胶质瘤进行诊断的是一种可行的方法。2.小结：肿瘤的发病机制是复杂的，具有早期难发现、晚期患者预后不良等特点，能够发现可靠的血清学生物标志物从而对早期肿瘤进行明确诊断并给予积极治疗就显得十分必要了。现阶段，肿瘤诊断的金标准仍然是对肿瘤组织进行组织活检，但它具有有创性及多次活检患者依从性差的缺点，而液体活检却有着无创性和可以连续检测的优势，只是目前的液体活检方法、检测结果的可信度及可分析的标志物还较少的事实不利于液体活检在临床上的应用，但相信随着芯片技术以及测序技术的日新月异，研究者不断开展大样本量的研究及液体活检具有组织活检无法超越的无创伤性优势的特点，预示着液体活检将会成为胶质瘤通过血清学进行早期诊断的一种新趋势。参考文献略